南湖通讯网讯（通讯员刘永轩）近日，我校生命科学技术学院和农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室微生物生物技术课题组在国际学术期刊Journal of Hazardous Materials上发表了利用生物锰氧化物进行氧化矿化新兴污染物双氯芬酸（DCF）的最新研究成果。论文以Complete oxidative degradation of diclofenac via coupling free radicals and oxygenases of a micro/nanostructured biogenic Mn oxide composite from engineered Pseudomonas sp. MB04R-2”为题，报道了利用一株工程锰氧化假单胞菌形成的生物锰氧化物（BMO）聚集体复合物来完全降解DCF，并研究证实细胞内加氧酶和内源性自由基在降解过程中的核心和联合作用，同时以斑马鱼胚胎为生物测定指示生物来评估了该活性氧化降解系统用于含DCF的自然湖水的降解与脱毒作用。
DCF是一种临床上广泛使用的止痛药和非甾体抗炎药，由于其结构上含有卤族和是一种多环芳香化合物而在自然环境中降解缓慢，因此成为城市污水甚至一般自然水体中普遍存在的一种新兴污染物，并随食物链蓄积到环境生物和人体，可引起人体发生多种免疫缺陷疾病和干扰人体神经系统的信号通路。传统的工业废水和生活污水处理技术，如沉积、絮凝、分离和吸附等并不能有效去除新型污染物，生物降解被认为是有希望且环境友好的处理方法。然而，已报道的多种生物处理方法主要是通过生物吸附或者是部分降解成毒性较低的降解代谢产物，迄今尚未见通过微生物降解作用达到完全矿化DCF的报道。
本研究首次证实了由锰氧化细菌和锰氧化物组成的高氧化活性BMO聚集体可完全降解DCF。通过敲除锰氧化活性抑制基因和插入异源细菌多铜氧化酶基因cotA遗传改造一株Pseudomonas sp. MB04R-2，使其具有更强的锰氧化活性和更快的BMO聚集体形成活性，并且达到具有可以降解痕量级（PPM至PPB）DCF的性能。BMO是一个由具有降解效用的几种活性成分组成的活性氧化降解系统，包括由被包埋于或吸附于锰氧化物复合物的细菌细胞，生物锰氧化物，以及各种自由基，而细菌细胞可表达加氧酶、额外表达的CotA、以及其他氧化还原酶（如超氧化物歧化酶、过氧化物酶以及非血红素铁蛋白家族加氧酶等）等活性成分赋予BMO成为一个具有强氧化势能活性物质复合物。这种复合物主要通过工程细菌的加氧酶和自由基的协同作用而实现对DCF的完全矿化降解，且该复合材料在自然水体中无需添加辅助成分（如金属锰）即可发生对DCF的降解并完全根除其毒性（图1），从而展现出优于各种单独生物细胞和无机锰氧化物处理系统的性能。
图1. BMO复合材料在天然湖水中降解DCF的时间过程以及BMO降解后斑马鱼胚胎在含有DCF自然湖水中的生物毒性试验
BMO复合物中的加氧酶和自由基被认为起着偶联协同作用并起着对DCF苯环开环的关键作用。其作用机制可能是，在向培养基中添加额外Mn(II)后，工程细菌细胞膜上的受体感知环境中Mn(II)浓度升高并在超过某一阈值后，细胞内的双组分系统（例如the Mnx system）调控起始胞内与锰氧化酶（包括表达外源导入的CotA）的表达上调，将Mn(II)氧化成Mn(III)和Mn(IV)氧化物，这些氧化物经跨膜转运出细胞并沉积于细胞表面形成锰氧化物沉积层，并逐渐积聚加厚形成微球型聚集体和成为初级成核中心来进一步氧化和吸收其他锰氧化物、金属离子和有机基质；由于在锰氧化作用中活跃的电子传递导致大量的超氧自由基和羟自由基的合成，部分自由基可能为合成的锰氧化物所捕获，并随锰氧化物跨膜转运至胞外；胞外的DCF被转运进入细胞内，与高Mn(II)浓度联合引发细胞内需要金属离子辅助传递电子的加氧酶和需氧性加氧酶表达上调；加氧酶与自由基联合作用导致在DCF苯环发生多种氧化降解反应，包括羟基化反应、氢化反应、氧合反应、羟基取代反应和环裂解和烷基降解反应，从而形成多种不同中间代谢物。加氧酶与自由基也可能进一步对含苯环的中间代谢物开环，而细胞内的其他降解酶也可能参与对中间代谢物的降解，最终转化为低分子量碳架物而进入细胞内基础代谢循环（如TCA循环）；由锰氧化物捕捉的自由基在细胞与锰氧化物界面也可以作用于DCF，并联合可能由于细胞在锰氧化物成矿作用而裂解所释放的胞内酶系实现对DCF的降解（图2）。
图2. BMO复合材料降解DCF的氧化降解机制示意图
鉴于其快速降解芳香族化合物的通用性能、方便快速的再生性能和仅需要通常反应条件的高适应性能，本系统有潜力拓展应用于其他环境难降解有机底物、或应用于环境有机污染物的大规模处理与连续处理的生物转化过程。
我校生命科学技术学院和农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室博士生刘永轩为论文第一作者，李林教授为通讯作者。嘉应学院生命科学学院李娇清讲师、许良政教授参与了部分论文工作。该研究得到了国家自然科学基金（32170124）、广东省农村振兴战略专项基金（2021A0305002）和广东省科技计划项目（2020B121201013）的资助。
【英文摘要】
Oxidative degradation can effectively degrade aromatic emerging contaminants (ECs). However, the degradability of lone inorganic/biogenic oxides or oxidases is typically limited when treating polycyclic ECs. Herein, we report a dual-dynamic oxidative system comprising engineered Pseudomonas and biogenic Mn oxides (BMO), which completely degrades diclofenac (DCF), a representative halogen-containing polycyclic EC. Correspondingly, recombinant Pseudomonas sp. MB04R-2 was constructed via gene deletion and chromosomal insertion of a heterologous multicopper oxidase cotA, allowing for enhanced Mn(II)-oxidizing activity and rapid formation of the BMO aggregate complex. Additionally, we characterized it as a micro/nanostructured ramsdellite (MnO2) composite using multiple-phase composition and fine structure analyses. Furthermore, using real-time quantitative polymerase chain reaction, gene knockout, and expression complementation of oxygenase genes, we demonstrated the central and associative roles of intracellular oxygenases and cytogenic/BMO-derived free radicals (FRs) in degrading DCF and determined the effects of FR excitation and quenching on the DCF degradation efficiency. Finally, after identifying the degraded intermediates of 2H-labeled DCF, we constructed the DCF metabolic pathway. In addition, we evaluated the degradation and detoxification effects of the BMO composite on DCF-containing urban lake water and on biotoxicity in zebrafish embryos. Based on our findings, we proposed a mechanism for oxidative degradation of DCF by associative oxygenases and FRs.
