南湖新闻网讯（通讯员 李焱龙）近日，作物遗传改良全国重点实验室、植物科学技术学院张献龙教授领衔的棉花遗传改良团队研究成果以“Single-Cell Transcriptome Atlas and Regulatory Dynamics in Developing Cotton Anthers”为题在Advanced Science 发表。该研究不仅建立了植物中首个详细的常温和高温四分体花药的单细胞转录图谱和染色质可及性图谱，还挖掘出高温通过影响花粉壁形成过程来调控雄性育性的新机制，为棉花和其它作物的抗高温育种提供了重要线索。
Advanced Science发表图
全球变暖导致极端高温天气频发，对作物的生长发育产生严重的负面影响，也是导致作物产量下降的重要因素。棉花作为重要的经济作物和战略物资，主要在夏季种植，常会遭遇高温胁迫引起花药败育而造成严重减产。因此，深入研究高温花药败育机理，挖掘耐高温基因，对耐高温育种至关重要。但目前，棉花耐高温基因挖掘尚处于起步阶段，且棉花花药组织不同类型细胞对高温的响应机制完全不清楚，严重制约了棉花耐高温育种工作。
单细胞视角解析棉花高温雄性不育新机制
该团队首先建立了高效、优质棉花花药细胞核提取方法，之后对常温和高温胁迫下的棉花四分体时期花药进行细胞核的提取、纯化，并进行单细胞转录组以及单细胞多组学（RNA+ATAC）文库的构建。研究者首先利用常温下的单细胞转录组构建了植物中首个完整且准确的四分体时期花药的单细胞转录图谱，发现花药细胞间的表达存在强烈的异质性，可划分为8个簇及18个亚簇。进一步挖掘出每个簇中特异表达基因，结合高质量的RNA原位杂交实验，帮助注释出花药所有的细胞类型且鉴定到大量不同细胞类型的特异标记基因，填补了植物花药大部分细胞类型缺乏标记基因的空白，将极大助力棉花及其它植物花药发育的功能研究。
随后，基于表达图谱，研究者对减数分裂细胞、中层细胞、绒毡层细胞分别进行了拟时序分析，不仅重构出了单细胞水平下的减数分裂过程，鉴定到大量新的调控减数分裂的基因，而且根据中层的拟时序和高精度半薄切片结果，提出了棉花花药中层细胞并不是在减数分裂结束后的第7个时期完成降解，而是在花药发育的第11时期协同绒毡层一起完成降解的这一生物学结论。同时，发现四分体时期花药绒毡层细胞功能转换十分迅速，且不同拟时间簇的绒毡层细胞具有不同的生物学功能。进一步，研究者构建了首个单细胞水平的植物绒毡层发育过程中转录因子间的调控网络，发现一些在绒毡层发育过程中起重要作用的新转录因子如MYB4、MYB52、ZFN1等。
接着，为了探究花药各类型细胞间出现表达异质性的原因，研究者将单细胞多组学中的表达信息与染色质开放信息进行融合，构建了棉花花药中的首个多组学融合图谱，发现棉花花药中基因的表达与染色质开放性呈正相关，并鉴定出了大量细胞类型特异性的染色质开放区域，且许多开放区域位于各类型细胞特异表达基因的启动子区，表明各类型细胞特异基因的表达与否很大程度取决于它们的染色质开放性程度。研究者进一步发现不同转录因子（TF）的motif染色质开放性在不同类型细胞中的开放程度不一样，表明花药各类型细胞表达的异质性是由于不同TF在不同类型细胞中差异调控导致。
为进一步探究花药各类型细胞是如何响应高温胁迫的，研究者以常温下四分体时期花药的单细胞转录图谱为参考，构建了高温下四分体时期花药的单细胞转录图谱。通过比较分析及统计高温下各类型细胞数目的变化进行卡方检测，发现花药各类型细胞对高温响应具有偏好性，且绒毡层细胞数目在高温下明显减少，尤其是绒毡层细胞中的一个细胞亚群在高温下完全消失，说明绒毡层细胞对于高温胁迫最为敏感。通过对每一类细胞进行高温下的差异表达分析，并对高温下的差异表达基因进行功能富集，发现花药各类型细胞会全面上调胁迫响应路径，并特异性地下调不同细胞类型中各自负责的生长和发育路径，因此研究者认为花药各类型细胞会牺牲各自的发育来抵御高温胁迫。
为了在单细胞水平上探索高温胁迫下花药染色质可及性的动态变化，研究者整合常温和高温胁迫下的花药多组学融合图谱，发现在高温下完全消失的那簇绒毡层细胞主要参与花粉壁的合成，且通过透射电子显微镜观察了常温和高温条件下第 8 时期花药里的花粉壁。发现相比于常温下已形成完整的花粉壁，高温会导致花粉外壁外层明显变薄，同时导致外壁外层缺乏完整的顶盖层和柱状层构造，表明花粉壁合成过程对高温极为敏感。进一步，研究者对高温下消失的绒毡层细胞进行了单细胞水平的基因共表达网络分析，发现了许多调控花粉壁形成的潜在基因模块及枢纽基因，其中包含多个已被报道的与花粉壁合成相关的基因，如MEE48、GhCYP703A2、MS188、QRT3、ACOS5等。而这些核心基因的染色质开放性和基因表达在高温下都是被明显抑制的，推测高温胁迫会导致花粉壁合成相关核心基因的染色质开放性下降，从而导致这些基因表达的沉默，最终导致高温下花粉壁合成异常。为验证此推测，研究者选取了GhCYP703A2和GhQRT3基因进行验证。单细胞表达分析和RNA原位杂交发现GhCYP703A2，GhQRT3的表达在高温下的绒毡层中均被明显抑制。GhCYP703A2，GhQRT3的敲除突变体均在常温下出现雄性不育表型。透射电镜结果显示，与野生型相比，cyp703a2 不能形成正常的包含顶盖层和柱状层的花粉外壁外层，qrt3花粉外壁外层失去刺突，花粉外壁内层明显增厚，花粉内壁基本消失。这些结果表明GhCYP703A2和GhQRT3是高温下棉花花药育性的关键正向调控因子。GhQRT3与GhCYP703A2 分别是参与果胶代谢途径的多聚半乳糖醛酸酶和参与孢粉素合成的月桂酸内链羟基化酶，研究者分别对高温下花药中的进行了果胶/多聚半乳糖醛酸成分的免疫荧光和孢粉素的自发荧光检测，结果发现高温下的果胶代谢过程和孢粉素合成过程均被扰乱。因此，研究者认为在高温胁迫下GhQRT3和GhCYP703A2的表达受到抑制，分别影响了果胶代谢和孢粉素的合成，导致花粉壁发育异常，从而导致雄性不育。
在这项研究中，研究者构建了首个常温和高温条件下四分体期花药的单细胞转录组图谱和染色质可及性图谱。描述了常温条件下花药中每种细胞类型的特异表达和表观遗传特征，为花药细胞间的功能分化提供了有力证据。描绘了单细胞水平的减数分裂、中层和绒毡层细胞发育过程中表达动态。更为重要的是，该研究揭示了单细胞水平花药各类型细胞间对高温胁迫反应的异质性，发现负责花粉壁形成的绒毡层细胞对高温最为敏感，并从中发掘出了QRT3 和CYP703A2等大量在绒毡层细胞中特异表达并响应高温胁迫的核心因子。该研究不仅为植物花药发育的研究提供了大量线索，也为未来作物耐热改良提供了思路。
据悉，华中农业大学植科院博士后李焱龙和在读博士生马欢欢为论文共同第一作者，作物遗传改良全国重点实验室和湖北洪山实验室张献龙教授和闵玲教授为论文共同通讯作者，新疆农科院经作所孔杰研究员、英国杜伦大学Keith Lindsey教授参与相关工作。该研究得到了国家重点研发计划项目(2022YFD1200805)，湖北省洪山实验室重大项目(2022hszd0042)，国家自然科学基金(32072024)，新疆农科院作物性状形成与生物育种前沿技术重点项目(xjnkywdzc-2022001)，中央高校基本科研业务费专项资金(2023ZKPY003)等项目的资助。
英文摘要
Plant anthers are composed of different specialized cell types with distinct roles in plant reproduction. High temperature (HT) stress causes male sterility, resulting in crop yield reduction. However, the spatial expression atlas and regulatory dynamics during anther development and in response to HT remain largely unknown. Here, the first single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility survey in cotton anther are established, depicting the specific expression and epigenetic landscape of each type of cell in anthers. The reconstruction of meiotic cells, tapetal cells, and middle layer cell developmental trajectories not only identifies novel expressed genes, but also elucidates the precise degradation period of middle layer and reveals a rapid function transition of tapetal cells during the tetrad stage. By applying HT, heterogeneity in HT response is shown among cells of anthers, with tapetal cells responsible for pollen wall synthesis are most sensitive to HT. Specifically, HT shuts down the chromatin accessibility of genes specifically expressed in the tapetal cells responsible for pollen wall synthesis, such as QRT3 and CYP703A2, resulting in a silent expression of these genes, ultimately leading to abnormal pollen wall and male sterility. Collectively, this study provides substantial information on anthers and provides clues for heat-tolerant crop creation.
审核人 闵玲
