南湖新闻网讯（通讯员 惠凤娇）近日，我校作物遗传改良全国重点实验室、湖北洪山实验室、植物科学技术学院张献龙院士领衔的棉花遗传改良团队，联合西南大学、新疆农业科学院，在iMeta上在线发表了题为“Robust CRISPR/Mb2Cas12a genome editing tools in cotton plants”的研究论文。该研究在棉花中建立了一种新型的CRISPR/Mb2Cas12a基因编辑系统，进一步评估了不同crRNA表达单元的效率，并最终评估了在棉花中应用多基因编辑的可行性。

CRISPR/Cas9基因编辑系统以优异的简便性、高效性和精确性实现靶向突变，迅速发展成为生物技术领域的里程碑；CRISPR/Cas12系统以独有的特点，迅速发展为一种前景广阔的基因编辑工具。但目前在棉花中开发的基因编辑工具相较于其他植物仍然很少，限制了棉花遗传改良的研究，因此在棉花中探索验证新型的基因编辑工具是十分有价值的。

在这项研究中，团队基于CRISPR/Mb2Cas12a系统构建了三种载体表达策略：tRNA-crRNA-tRNA、HH-crRNA-HDV和单转录单元（STU），发现这三种表达系统均可以产生90%以上的编辑效率，编辑窗口主要集中在PAM位点下游13到26nt之间，全基因组测序检测没有发现任何脱靶现象。通过使用CRISPR/Mb2Cas12a编辑系统，我们成功的获得了无转基因成分的无棉酚棉花植株，这也是基因编辑技术相对于传统转基因策略的重要优势之一（图1）。

图1 棉花中开发的高效CRISPR/Mb2Cas12a系统

经过研究发现，Mb2Cas12a在棉花基因编辑中表现出广泛的温度适应性，在22℃至32℃的条件下都表现出了高活性。对编辑植株的突变模式分析表明，Mb2Cas12系统产生的DNA缺失位置和大小不受温度变化的影响。进一步在棉花中进行全基因组PAM分析显示，具有靶向TTV PAM特性的Mb2Cas12a可以覆盖59.59%的棉花基因组，与SpCas9相比增加了2.8倍，与LbCas12a相比增加了2.6倍。我们进一步通过实验验证发现Mb2Cas12a在ATTV PAM位点实现了~15.50%的编辑效率，证明了其在扩大基因编辑范围方向的有效性。

为了评估Mb2Cas12a在棉花植株中的多基因编辑活性，我们在单个表达盒中设计了8个crRNAs，验证发现8个靶标位点的突变频率从1.45%到86.96%不等，中间crRNA单元（loci 3-4）的突变效率相对较低，从1.82%到17.93%不等。相比之下，crRNA单元两端的突变效率较高，例如crRNA1、crRNA7和crRNA8的突变效率分别为39.7%、71.47%和58.62%（图2）。

图2 棉花中Mb2Cas12a广泛温度适应性和多基因编辑

该研究成功开发了棉花高效的CRISPR/Mb2Cas12a基因编辑系统，大大提高了棉花基因编辑的能力，扩大了全基因组可编辑的范围。同时，我们建立了基于CRISPR/Mb2Cas12a的高效多基因编辑系统，为创建个性化的棉花种质资源提供了宝贵的技术工具，促进了该领域的基础生物学研究。

据悉这是棉花团队开发的第10套基因编辑工具，前期该团队开发了Cas9, Cas12a, Cas12b, CBE, ABE, ABE8e, dCas9-TV, Cas13a 等工具，能够在靶标位点进行敲除、敲入、敲高、敲低以及SNP点突变等精准修饰，为棉花功能基因组研究和分子设计育种提供了完备的工具箱（Zhang et al., 2018, PBJ; Li et al., 2019，PBJ; Wang et al., 2020, PBJ; Qin et al., 2020, PBJ; Li et al., 2020, PBJ; Hakim et al., 2020, Advanced Science; Wang et al., 2022, BMC Biology; Yu et al.,2022, Plant Communications; Sun et al., 2023, Advanced Science; Wang et al., 2024, Genome Biology）。

我校植物科学技术学院博士研究生惠凤娇为该论文的第一作者，我校金双侠教授、张献龙教授，西南大学张勇教授为该论文的通讯作者。新疆农科院李波研究员，西南大学唐旭博士，我校许忠平博士、王冠英博士、博士生孟庆营、胡咏雪等参与了部分研究。该研究得到了科技创新2030-重大项目、国家自然科学基金杰出青年基金项目和湖北洪山实验室重点项目等资助。

审核人：金双侠

【英文摘要】

The efficiency and accuracy of the CRISPR/Mb2Cas12a system were demonstrated in cotton, achieving an efficiency of over 90% at target sites. Notably, Mb2Cas12a exhibited significant tolerance under different temperatures ranging from 22°C to 32°C. Additionally, the Mb2Cas12a system revealed effective editing at more relaxed VTTV PAM sites in the cotton genome, which expanded the genome editing range by approximately 2.6-fold than the wide-type LbCas12a. Finally, a multiplex genome editing system was also developed based on Mb2Cas12a, enabling simultaneous editing of eight target sites using a single crRNA cassette.

论文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/imt2.209