南湖新闻网讯（通讯员 丁霄）11月10日，植物学领域国际学术期刊Trends in Plant Science以Feature Review的形式在线发表了我校棉花团队关于植物基因编辑的长文综述，系统阐述了CRISPR/Cas9基因编辑系统在大田农作物、水果和蔬菜中的应用，重点探讨了该技术体系的作用机制、特异性、编辑效率、局限性以及未来挑战。同时，该文还对如单碱基编辑系统、xCas9、Cas12a (Cpf1)和Cas13等目前新兴的其它基因组编辑工具在植物中的应用前景提出了独特的观点。

——基因编辑为何物？我校棉花基因编辑如何取得突破？

基因编辑技术是指在基因组水平上对DNA序列进行定点改造的遗传操作技术,是近几年发展起来的生命科学领域的革命性、颠覆性技术,已连续多年入选国际顶级科学刊物Nature/Science评选的“世界十大科学进展”。目前应用比较广泛的基因编辑技术主要有ZFN, TALEN, CRISPR等三种。而自 2013 年在真核生物中成功应用以后，CRISPR/Cas9 系统成为生命科学研究的关注热点和近年来最受欢迎的基因组编辑系统。该系统具有稳定性强、效率高和操作简单的特点。利用 CRISPR/Cas9 技术能够成功实现基因组水平的基因敲除，基因转录调控和修饰等。当前以CRISPR为代表的植物基因编辑技术有望引发现代农业科技中作物育种和农业生物技术研发的革命,彻底颠覆传统育种方式。

时间回到2012年，刚刚从美国做完博士后研究回国的金双侠教授着手建立棉花的功能基因组研究技术平台，起初，团队把研究重点放在传统的农杆菌T-DNA插入创造突变体上，经过大量实践证明传统T-DNA插入技术不适用与棉花功能基因组研究，原因在于目前生产上种植的棉花是异源四倍体，有 52 条染色体，基因组庞大、复杂，同源重复序列多，同一基因也具有多个拷贝，目前很难获得有效的单基因突变体，而且棉花基因组庞大，如果要实现单个基因的饱和敲除，需要获得180万个独立的T-DNA插入株系，这是现有的技术条件、物质条件下几乎不可能完成的任务。

在张献龙教授的支持下，团队成员迅速调整方向，尝试将当时新兴TALEN技术引入到棉花功能基因组研究中，踏上了棉花基因组编辑的研究的征程。随后团队见证CRISPR强大的优势，迅速调整方向，尝试将水稻、拟南芥中的CRISPR编辑体系引入棉花当中，但实验结果总是不尽人意。棉花作为异源四倍体植物，有其自身的特性，为何不能将调控元件改为棉花自身的元件？随后通过对引导RNA启动子进行了替换，正式建立了棉花基因编辑系统，编辑效率高达85%以上，可以和水稻等模式植物中的编辑效率相媲美，相关系统不仅应用于国内棉花研究团队，更是推广到美国、澳大利亚等国内外100多个实验室。

团队利用全基因测序的方法对基因编辑在植物中的的脱靶效应进行了系统研究，证明棉花基因编辑系统非常精准、脱靶率极低，为棉花基因编辑的推广应用又扫平一个障碍。随着生物信息学的发展，棉花团队定位到很多SNP位点，如何通过基因编辑的方法实现单个碱基的突变成为了团队面临的新挑战，棉花团队迅速与中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞团队合作首次实现了棉花单碱基编辑。

但是挑战依然存在，如何实现在棉花基因组高效定点敲入目标序列一直是一个难题，博士生李波首次报道了Cpf1在棉花编辑中的应用，相较于Cas9，Cpf1切割产生的粘性末端将有利于实现棉花基因组定点敲入。正是这一系列扎实的研究工作，引起了国内外同行的广泛关注，今年4月，Trends in Plant Science主编Susanne Brink博士主动邀请棉花团队撰写植物基因编辑的长文综述并将这篇论文列为本年度的Feature Review, Feature Review是Trends in Plant Science 杂志发表的各种文章类型中数量最少、篇幅最长、影响力最大的文章类型。

——植物基因编辑工具有哪些新进展？

CRISPR-Cas9基因组编辑技术依赖于PAM序列及sgRNA和靶DNA的碱基互补配对来识别靶位点。PAM序列依赖性很大程度上限制了基因组上可被编辑的位点。基于CRISPR-Cas9系统的一些衍生工具如碱基编辑，PAM序列依赖性对靶向范围的限制更大。尽管近些年已经挖掘了很多识别不同PAM序列的Cas9蛋白或者变体用于基因组编辑，但是它们大都识别较为复杂的PAM序列，应用范围受限。xCas9和SpCas9-NG是最近报道的两个Cas9蛋白变体，它们识别更加简化的NG PAM序列，因此能更有效地缓解PAM限制性问题。

核酸酶Cas9及其变体切割DNA产生的平末端对于插入外源基因存在效率低下的问题，最近开发的CRISPR-Cas12a（Cpf1）与CRISPR / Cas9相比，Cpf1分子量更小，仅需一个小RNA分子、脱靶效率更低、剪切位点离PAM很远且产生便于DNA插入的黏性末端等优势。最近，EnAsCas12a更是进一步提高了多重基因编辑、单碱基编辑以及内源基因活化的效率。

基因组的编辑往往是不可逆的过程，在植物的生长过程中要应对复杂的外界条件，基因组水平的编辑就存在一定的局限性，如何在不改变基因组的条件下实现RNA的编辑显得尤为重要。CRISPR - Cas13，作为RNA引导的RNA编辑器，可以特异性靶向并切割病毒RNA和真核细胞中的内源RNA。目前，植物中已成功利用该系统抗马铃薯病毒(RNA病毒)。最近，张锋团队利用失活的Cas13将RESCUE引导到RNA转录本中的目标胞嘧啶碱基上，完成C到U的转化，更是证明了CRISPR / Cas13作为RNA 编辑器的广阔应用前景。

Cas9与Cpf1差异比较示意图

核酸酶小型化一直是基因编辑研究领域的重要内容，小型化改造将有利基因编辑系统的递送。CRISPR-Cas14a，能够结合并切割单链DNA的目标序列。其大小约是其他Cas蛋白的一半。与Cas9不同，Cas14不需要识别PAM序列。另外，识别单链DNA方面比Cas13或Cas12更具特异性。因此，CRISPR/Cas14a在抗植物单链DNA病毒具有巨大的潜力。

碱基编辑（Base Editing ,BE）可在不需要供体DNA模板或不产生DSB，甚至不依赖于HDR和NHEJ修复途径的情况下，在靶标上引起精确且可预期的核苷酸变化。

BaseEditing示意图

——植物基因编辑的适用性如何？

目前 CRISPR/Cas9 在植物基因组编辑中的应用主要包括基因功能研究和作物遗传改良，编辑形式可分为功能基因的敲除、基因 (片段) 的定点插入或替换、单碱基编辑和基因表达调控。CRISPR/Cas9系统已成功应用许多主要作物上，如拟南芥，水稻，小麦，玉米，大豆，高粱，棉花，油菜籽，大麦，本氏烟草，番茄，马铃薯，甜橙，黄瓜，生菜，矮牵牛，葡萄，苹果，木薯，西瓜等。以小麦为例，小麦基因工程以高难度著称，部分原因是许多小麦株系都是“六倍体”，传统技术难以同时将多拷贝基因进行突变纯和。而通过基因编辑技术将小麦3组基因组上的MLO基因全部敲除，使得基因编辑小麦获得持久、广谱的白粉病抵抗能力。基因编辑多位点编辑的优势同样在二倍体的水稻育种中拥有无限的潜力，科研人员利用CRISPR/Cas9系统在水稻育种中间材料中同时编辑多个抗性和育性基因，成功将具有优良性状的育种中间材料快速开发成优质多抗的两系不育系，不仅显著加快了不育系的，而且有利于杂种优势的利用。利用CRISPR-Cas基因编辑技术,育种人员可以将自然存在的糯玉米性状直接引入最优秀的杂交品种中,培育出与传统玉米非常相似的新产品,解决了糯玉米产量低的问题。植物基因编辑技术让作物育种人员的工作更有效率且更精准。

——植物基因编辑的发展方向是什么？

文中对于CRISPR/Cas系统未来的发展由难到易（从基因定点敲入到基因定点敲除）分别做了不同的描述，同时也是棉花基因编辑团队攻克的研究方向。过去转基因备受争议，除了外源基因的安全性问题以外，插入位点的不确定性同样是转基因安全问题之一，同时插入位点的差异不仅仅导致外源基因表达效率存在差异，也对插入位点附近的序列产生不可预测的影响，为目标性状研究带来极大的不确定性，因此如何实现序列定点敲入是植物基因编辑技术领域的桂冠。

不同CRISPR系统的未来发展趋势

——当前CRISPR / Cas9系统面临哪些挑战？

尽管CRISPR / Cas9系统是一种强大的基因编辑工具，但依然存在很多局限性。如：编辑效率，脱靶问题，PAM限制，同源重组效率低下，以及如何提高转化效率降低转化成本以及核酸酶小型化问题等等。同时，基因编辑技术的出现为作物分子育种提供了新的机遇, 但仍然面临政策法规和技术优化两方面的挑战。目前, 国际上对基因编辑作物是否属于转基因生物尚未有明确一致的定论, 其监管标准也存在较大争议。美国农业监管部门认为基因编辑作物 (genome edited crop, GEC) 是通过细胞自我修复机制而产生的突变体, 与作物自然突变以及物理和化学诱导突变极其相似, 都是少数几个核苷酸的改变, 因此, GEC不被定义为GMO。欧盟对GMO监管较为严格, 其认为只要有外源DNA转入, 而不论最终植物中是否还存在外源DNA, 都被定义为GMO。从科学角度来讲, 基因编辑诱导的突变与自然突变以及物理和化学诱导突变性质一样, 实质无法区分, 因此欧盟也有建议将GEC定义为非GMO。但基于政治考虑, 欧盟尚未下明确定论, 对GEC的监管标准存在不确定性。目前, 中国对于基因编辑作物的监管标准尚无明确的规定, 因此亟需出台相关的政策法规以正确引导基因编辑育种。

CRISPR / Cas9系统局限性示意图

中国是一个农业大国，但是与发达国家相比，中国的农业技术发展尤其是种业发展，缺乏自主知识产权，品种和创新作为种业发展的核心竞争力缺少世界领先的科研实力作为支撑。新的基因编辑技术为培育高抗低耗的作物新品种奠定了基础，将推动新型生物育种技术和可持续农业的高速发展，推动农业发展新旧动能转换。值此机遇，棉花基因编辑团队期待在未来十年通过基因编辑技术在棉花育种，栽培，机采实现新的突破。

本研究得到了国家科技部转基因作物研究专项（2016ZX08010001-006）、中国工程院咨询项目（编号2018-XY-63）、中央高校基础研究基金（2013PY064、2662015PY028、2662015PY091、0900206328）的支持。巴基斯坦籍留学生Hakim 博士为论文第一作者，华中农业大学棉花团队张献龙教授、金双侠教授为共同通讯作者。

审核人：金双侠

论文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1360138519302432?from=singlemessage